| 赵晓红,向姝霖,刘芳,夏红,曾希,苏波,凌晖,苏琦.稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定.[J].中南医学科学杂志.,2016,(1):5-10. |
| 稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定 |
| Construction and Identification of MGC803 CellTransfacted by RORα Gene |
| 投稿时间：2015-09-22 修订日期：2015-12-01 |
| DOI： |
| 中文关键词: 维甲酸相关孤核受体α 真核表达 转染 人胃癌MGC803细胞 |
| 英文关键词:RORα eukaryotic expression transfection human gastric cancer MGC803 cells |
| 基金项目:国家自然科学基金 (81374013,4),湖南省高校创新平台开放基金(09K074),湖南省卫计委科研课题 (B2015-182). |
| 作者 | 单位 | | 赵晓红 | 南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心,湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室, 湖南 衡阳 421001
海南省妇幼保健院妇产科 | | 向姝霖 | 南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心,湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室, 湖南 衡阳 421001
怀化市第一人民医院肿瘤科 | | 刘芳 | 南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心,湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室, 湖南 衡阳 421001 | | 夏红 | 南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心,湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室, 湖南 衡阳 421001 | | 曾希 | 南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心,湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室, 湖南 衡阳 421001 | | 苏波 | 南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心,湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室, 湖南 衡阳 421001 | | 凌晖 | 南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心,湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室, 湖南 衡阳 421001 | | 苏琦 | 海南省妇幼保健院妇产科 |
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| 中文摘要: |
| 目的 构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的cDNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORα cDNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素筛选pcDNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株；Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致；表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的cDNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORα mRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。 |
| 英文摘要: |
| Objective To construct the eukaryotic expression vector inserted by RORα gene,and establish human gastric cancer MGC803 cell lines that express higher level RORα gene to lay the foundation for investigating the function of RORα.MethodsBased on the complete cDNA sequence of RORα isoform,to design a pair of primers with restriction sites.To extract the total mRNA from human gastric cancer MGC803 cells as a template for synthesize first strand cDNA of RORα,and amplify the complete sequences of target gene by the above primers.Then,after double enzyme digestion,the amplified sequences was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) for transforming into E.coli DH5α.The positive strains containing pcDNA3.1(+)-RORα were screened by ampicillin,and were identified by restriction analysis and sequencing.MGC803 cells was transfected by the identified recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-RORα,and was screened by G418 for obtaining stable passage RORα/MGC803 cell lines.RORα expression of the cell lines was certified by Real-time PCR and Western blot.ResultsBy restriction analysis,the constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα contains about 1640bp insert fragment,which is consistent with the expected size.By sequencing,the insert fragment's base sequence of the expression vector was exactly the same cDNA sequence of RORα1 gene.To transfect MGC803 cells by the constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα,we obtained stable passage RORα/MGC803 cell lines that express higher level RORα mRNA and protein.ConclusionWe successfully constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα and RORα/MGC803 cell lines which express higher level RORα gene. |
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